Krionika nėra užbaigtas receptas: atvėsinti, saugoti ir laukti. Tai aktyvi tyrimų sritis, o skirtumas tarp 1970 metais ir šiandien atlikto išsaugojimo yra didelis ir išmatuojamas. Kiekvienas smegenų ultrastruktūros išsaugojimo tikslumo pagerėjimas tiesiogiai didina tikimybę, kad ateities medicinos technologijos leis atgaivinti žmogų su nepažeista atmintimi, asmenybe ir tapatybe. Šiame straipsnyje aprašoma, kaip sritis juda į priekį, ką ji įrodė, ko neįrodė ir kas dirba šį darbą.
Sritis, o ne vienas metodas
Lemiamas posūkis buvo perėjimas nuo užšaldymo prie vitrifikacijos, tai yra krioprotektoriumi prisotinto audinio perėjimo į stiklo būseną be ledo. Šį metodą 1984 metais pasiūlė kriobiologas Greg Fahy, o žmonių atvejams jis pritaikytas apie 2000 metus.
Vitrifikacija neatsirado iš karto tobula, o priežastis aprašyta kitame skyriuje. Krioprotektorių koncentracijos, reikalingos ledui išvengti, yra tokios didelės, kad tampa toksiškos, todėl kiekvienas vėlesnis vitrifikacijos tirpalas buvo bandymas praplėsti tarpą tarp koncentracijos, kuri vitrifikuoja, ir koncentracijos, kuri žudo.
Keturios problemos, kurias sprendžia ši sritis
1. Krioprotektorių toksiškumas. Tai pagrindinė problema, ir standartinis šaltinis tai pasako be užuolankų. Human Cryopreservation Procedures (de Wolf ir Platt, faktus tikrino Brian Wowk) formuluoja taip: tikrasis kriobiologijos iššūkis yra ne sukurti tirpalus, atsparius ledo susidarymui lėtai vėsinant, o sukurti netoksiškus vitrifikacijos tirpalus.
Pažanga čia buvo ne vienas proveržis, o konkrečių projektavimo rezultatų seka. Kai kurių krioprotektorių toksiškumas sumažėja juos derinant su kitais; geriausiai žinomas atvejis yra Fahy atradimas, kad DMSO neutralizuoja formamido toksiškumą. Kompozicinis kintamasis qv* leidžia numatyti bendrą vitrifikacijos tirpalo toksiškumą, todėl tirpalų kūrimas tapo racionalus, o ne empirinis. Jį pritaikius gautas netikėtas rezultatas: silpnesni stiklo formuotojai yra palankesni gyvybingumui, todėl didesnė etilenglikolio koncentracija vietoj propilenglikolio padidino ląstelių gyvybingumą. Sintetiniai ledo blokatoriai problemą puola iš kitos pusės. 2000 metais Brian Wowk su kolegomis parodė, kad polimerai gali slopinti heterogeninę ledo nukleaciją, o gautas polivinilo alkoholio kopolimeras ir poliglicerolis, parduodami kaip X-1000 ir Z-1000, sumažina mažiausią vitrifikacijai reikalingą krioprotektoriaus koncentraciją. Mažiau reikalingo krioprotektoriaus reiškia mažiau įneštino toksiškumo.
Dabartinė šios problemos būklė aprašyta tame pačiame šaltinyje. Gerose sąlygose atliktais atvejais manoma, kad smegenų gyvybingumas prarandamas ankstyvose ir vidurinėse krioprotekcinės perfuzijos stadijose dėl krioprotektorių toksiškumo ir jų sukeltos dehidratacijos. Ultrastruktūros išsaugojimas ir gyvybingumo išsaugojimas šiandien nėra tas pats pasiekimas, ir kol kas pasiekiamas tik pirmasis.
2. Krioprotektoriaus įvedimas į visas smegenis. German ir kt. aiškiai paaiškina, kodėl visos smegenys yra sunkesnis uždavinys nei pjūvis. Krioprotektorius turi atkeliauti kraujagyslėmis, o pralaidumas ir hidraulinis laidumas prie kraujo ir smegenų barjero nesutampa dėl didelės akvaporino-4 koncentracijos astrocitų perivaskulinėse kojelėse. Jų viso smegenų protokolas pavyko vieną kartą iš trijų. Akvaporinai įvardijami kaip taikinys, vertas tiesioginio puolimo.
3. Šilumos grąžinimas. Atšildymas yra sunkesnė ciklo pusė. Vėsinant ledą reikia aplenkti vieną kartą; atšildant audinys tą patį intervalą pereina lėčiau, todėl ledas, kuris nesusidarė leidžiantis žemyn, gali susidaryti dabar. Laidusis atšildymas veikia nuo paviršiaus į vidų, todėl turi dydžio ribą, kurią German grupė sieja su didžiausiu audiniu, kurį jų metodas pajėgia apdoroti. Didesniems tūriams reikia tūrinių metodų. 2023 metais Minesotos universiteto grupė vitrifikavo žiurkių inkstus, laikė juos iki 100 dienų ir atšildė vidutiniu 63.7°C per minutę greičiu, sužadindama silicio dioksidu dengtas geležies oksido nanodaleles radijo dažnio lauke; inkstai buvo transplantuoti ir palaikė gyvybę. Tais pačiais metais Ramon Risco grupė Sevilijoje pasiekė 217.8°C per minutę naudodama didelio intensyvumo fokusuotą ultragarsą, kuris šilumą tiekia per visą tūrį ir nereikalauja nanodalelių audinyje. 2025 metų darbas išplėtė vitrifikaciją ir nanošildymą iki litro dydžio tūrių. Nė vienas metodas nebuvo išbandytas su žmogaus smegenų dydžio objektu.
4. Skilinėjimas žemiau stiklėjimo temperatūros. Žemiau stiklėjimo perėjimo kietoji medžiaga toliau traukiasi ir nebegali atsipalaiduoti, todėl įtampą išleidžia skildama. 2025 metų tyrimas parodė, kad skilimas seka šiluminį susitraukimą ir greito vėsinimo sukeltus temperatūros gradientus. Švelninimo priemonės yra lėtas vėsinimas iki kriogeninių temperatūrų ir saugojimas tarpinėje temperatūroje.
Kas buvo įrodyta ir su kuo
Toliau pateikti teiginiai išdėstyti pagal tai, ką kiekvienas eksperimentas iš tikrųjų nustatė ir kokioje sistemoje.
Visas organas, vitrifikuotas ir transplantuotas. Fahy grupė 21st Century Medicine 2009 metais pranešė, kad triušio inkstas, prisotintas vitrifikacijos tirpalu M22, atvėsintas iki -135°C be ledo, atšildytas ir transplantuotas, veikė kaip vienintelis gyvūno inkstas. Tai iki šiol aiškiausias įrodymas, kad sudėtingas organas gali išgyventi visą ciklą.
Ultrastruktūra išsaugota visose smegenyse fiksavimo būdu. Aldehidu stabilizuota krioprezervacija, paskelbta žurnale Cryobiology 2015 metais, 2018 metais laimėjo Brain Preservation Foundation stambiųjų žinduolių prizą, nes išsaugojo sinapsinį jungtingumą visose kiaulės smegenyse; tai po atšildymo patvirtinta trimate elektronine mikroskopija. Glutaraldehidas pirmiausia fiksuoja ultrastruktūrą, o tai atmeta biologinį to audinio atgaivinimą; ką tai duoda ir kiek kainuoja, aprašyta skiltyje išsaugojimas be užšaldymo.
Ultrastruktūra išsaugota visose smegenyse vien vitrifikacija. 2026 metų preprinte Fahy, Ralf Spindler, Brian Wowk ir kolegos praneša apie žinduolių smegenų ultrastruktūrinę ir histologinę krioprezervaciją vitrifikacijos būdu be išankstinio fiksavimo aldehidu. Recenzavimas dar nebaigtas.
Funkcija atkurta pelių hipokampe. 2026 metų kovą Alexander German su kolegomis Erlangeno ir Niurnbergo universitete žurnale PNAS paskelbė straipsnį apie suaugusių pelių hipokampo funkcinį atsigavimą po krioprezervacijos vitrifikacijos būdu. Pjūviai ir visos smegenys in situ buvo laikomi žemiau stiklėjimo temperatūros nuo dešimties minučių iki septynių parų, paskui atšildyti ir tirti registruojant signalus. Sugrįžo ramybės membranos potencialai, sinapsinis perdavimas, metabolinis atsakas ir ilgalaikė potenciacija. Ilgalaikė potenciacija po vitrifikacijos siekė 138.06 ± 6.90%, palyginti su 157.68 ± 7.14% kontrolinėje grupėje, P = 0.072, atitinkamai iš septynių ir aštuonių pjūvių iš septynių pelių. Šis skirtumas nėra statistiškai reikšmingas, tačiau esant tokiai imčiai palyginimas neturi galios ir atmesti tikro sumažėjimo, o autoriai rezultatą vadina trumpalaikiu atsigavimu. Išvada tokia: mokymosi ir atminties ląsteliniai mechanizmai išliko veikiantys visiškai sustojus molekuliniam judrumui, pelės hipokampe, kelių parų laikotarpiu. Tai nėra rezultatas apie žmogaus smegenis, žmogaus dydžio organus ar ilgą saugojimą. PNAS 2026 metų birželį paskelbė nepriklausomą komentarą apie šį darbą.
Gyvi žmogaus smegenų audiniai išsaugoti ir atkurti. 2024 metais Fudano universiteto grupė paskelbė protokolą, kurį vadina MEDY, pagrįstą metilceliulioze, etilenglikoliu, DMSO ir Y27632. Po atšildymo žmogaus smegenų audinys ir nerviniai organoidai išlaikė struktūrą, ląstelių įvairovę ir nervinę funkciją.
Išsaugojimo kokybės matavimas
Kokybės matavimu vadinami du skirtingi dalykai, ir jų sumaišymas yra būdas sričiai raminti pačiai save. Vienas matuoja iš tikrųjų pasiektą išsaugojimą. Kitas matuoja pažeidimą, kurį pacientas patyrė pakeliui. Abu turi būti atvejo ataskaitoje, bet tik pirmasis yra rezultato įrodymas.
Rezultato matai: ką pavyko išsaugoti
Standartinis šaltinis nurodo tris, kiekvieną su savo metodu. Ledo susidarymo pašalinimas vertinamas kompiuterine tomografija, kuri skiria vitrifikuotas sritis nuo užšaldytų, nes ledo ir aplinkinio vitrifikuoto tirpalo tankis skiriasi. Ultrastruktūros išsaugojimas vertinamas elektronine mikroskopija mikrolitro dydžio smegenų mėginiuose. Gyvybingumas tuose pačiuose mėginiuose vertinamas tyrimais, pavyzdžiui, kalio ir natrio santykiu. Šaltinis standartą formuluoja aiškiai: kiekvienoje atvejo ataskaitoje turi būti kompiuterinės tomografijos vaizdai ir elektroninės mikroskopijos nuotraukos, dokumentuojančios pasiektą vitrifikacijos ir ultrastruktūros išsaugojimo laipsnį.
Tas pats šaltinis atvirai kalba apie trečiąjį matą: dėl pirmiau minėto toksiškumo aukštų gyvybingumo rodiklių iš paciento smegenų mėginių šiandien pasiekti neįmanoma. Geras šiandienos atvejis yra tas, kuris parodo vitrifikaciją ir ultrastruktūros išsaugojimą, o ne gyvybingumą.
Poveikio matai: ką patyrė pacientas
S-MIX, standartizuotas išeminio poveikio matas, paverčia atvejo temperatūros ir kraujotakos istoriją lygiavertėmis išemijos minutėmis normalioje kūno temperatūroje, šiltai išemijai suteikdamas didesnį svorį nei šaltai. Antrasis matas yra pradinis vėsinimo greitis, normalizuotas pagal paciento svorį. Šie matai leidžia atvejus palyginti ir vertinti protokolų pakeitimus. Jie aprašo sąlygas, kuriomis išsaugojimas buvo atliktas. Jie nematuoja, kaip pavyko.
Ką matuoja Tomorrow.bio
Kompiuterinė tomografija atliekama kiekvienu mūsų atveju, todėl vitrifikacijos laipsnis yra dokumentuojamas, o ne numanomas. Esame tomografija ištyrę daugiau pacientų ir paskelbę daugiau rezultatų nei bet kuri kita krioprezervacijos organizacija; atskiros atvejų ataskaitos yra viešos ir jas galima perskaityti visas. Elektroninei mikroskopijai reikia aiškaus sutikimo paimti smegenų audinio mėginius, todėl ji atliekama tik ten, kur narys tokį leidimą davė; iki šiol tai vienas atvejis.
Šis skirtumas svarbus skaitant bet kurios organizacijos kokybės teiginius: tomografija pasako, ar susidarė ledas, ir tik elektroninė mikroskopija pasako, kas nutiko sinapsėms.
Kas dirba šį darbą
21st Century Medicine sukūrė triušio inksto rezultatą, aldehidu stabilizuotą krioprezervaciją, qv* sistemą, M22 ir sintetinius ledo blokatorius. Daugiau šiandien naudojamos krioprotektorių chemijos kilo iš čia nei iš bet kurios kitos vietos.
Alexander German grupė Erlangeno ir Niurnbergo universitete atliko pirmiau minėtą funkcinio atsigavimo darbą. German yra molekulinės neurologijos gydytojas mokslininkas ir vienas iš Hiber, dirbančios su struktūriniu smegenų išsaugojimu, įkūrėjų.
Advanced Neural Biosciences, 2008 metais įkurta Aschwin de Wolf ir Chana Phaedra, yra vienas iš nedaugelio institutų, skirtų būtent smegenų kriobiologijai. Ji siekia vitrifikacijos tirpalų su mažu toksiškumu, maža klampa ir geru prasiskverbimu pro kraujo ir smegenų barjerą, taip pat tiria negrįžtančio srauto problemą, kai audinys po delsos nebeleidžia perfuzijos. De Wolf yra vienas iš standartinio procedūrų šaltinio, cituojamo visame šiame straipsnyje, autorių.
Organų bankininkystės sritis tiekia įrankius, kurie perkeliami į krioniką. Minesotos nanošildymo darbas gimė toje bendruomenėje, o ne krionikoje.
Konektomika apibrėžia, ką visa tai gali reikšti. 2025 metais MICrONS konsorciumas paskelbė kubinį milimetrą pelės regos žievės, kuriame yra apie 200,000 ląstelių ir 523 milijonai sinapsių; tai daugelį metų dirbusio tarptautinio konsorciumo darbas. Tai mažas mažų smegenų tūris, bet kartu tai daugiau sinapsių, nei prieš dešimtmetį kas nors būtų pajėgęs sukartografuoti.
Brain Preservation Foundation pati išsaugojimo neatlieka, bet atlieka didelę dalį vertinimo: skiria prizus su paskelbtais kriterijais ir nepriklausomu elektroninės mikroskopijos patikrinimu.
Tomorrow.bio ir European Biostasis Foundation dirba taikomojoje pusėje: budėjimo ir stabilizavimo protokolai, perfuzijos įranga, logistika, leidžianti pasiekti pacientą laiku, ir ilgalaikis saugojimas EBF įstaigoje Rafce, Šveicarijoje, kur pirmasis žmogaus dydžio tarpinės temperatūros saugojimo indas pradedamas bandyti. Berlyne statoma antra laboratorija. Dauguma šiame puslapyje pateiktų rezultatų gauti kitų grupių.
2024 metų apžvalga apie struktūrinį smegenų išsaugojimą pateikia argumentus ir jų neapibrėžtumus recenzuojamame leidinyje. Tarp jos autorių yra Aschwin de Wolf.
Kas būtų įrodymas prieš
Trys rezultatai pakirstų šią poziciją, ir kiekvieną iš jų dabartinė tyrimų programa galėtų gauti.
Jei paaiškėtų, kad krioprotektoriaus pristatyti pro nepažeistą kraujo ir smegenų barjerą visų smegenų mastu neįmanoma, pjūvių rezultatai liktų įdomūs, bet nustotų būti aktualūs. Jei būtų parodyta, kad dabartiniai protokolai sinapsinę ultrastruktūrą ne pažeidžia, o įprastai sunaikina, pagrindinis teiginys žlugtų. Jei paaiškėtų, kad ilgalaikė atmintis iš esmės priklauso nuo nuolatinio elektrinio aktyvumo, o ne nuo išsaugotos struktūros, išsaugojimas saugotų ne tą dalyką.
Nė vienas iš šių dalykų neįvyko, o įrodymai kiekvienu atveju krypo priešinga linkme. Tai lieka klausimai, kuriuos verta stebėti.
Kodėl svarbi kryptis
Niekas iš viso to nekeičia pozicijos, kad atgaivinimas šiuo metu neįmanomas. Keičiasi tempas, kuriuo gerėja išsaugojimo tikslumas, o būtent tikslumas lemia, su kuo ateities technologijai tektų dirbti. Keturios bendruomenės mažina skirtingas problemos dalis: kriobiologija, organų bankininkystė, konektomika ir klinikinė medicina. Rezultatai tarp jų keliauja. Galimi keliai, į kuriuos tai veda, aprašyti skiltyje kaip galėtume pasiekti atgaivinimą.
Trumpai: Tyrimai gerina krioprotektorius, organų išsaugojimą, smegenų struktūros matavimą ir atšildymą. Šie pasiekimai gali pagerinti išsaugojimo kokybę, bet žmogaus atgaivinimo jie neįgalino.
Išbandykite šią praktinę priemonę
Naudokite interaktyvią priemonę, kad išnagrinėtumėte šiame straipsnyje keliamą klausimą.
Įkeliamas interaktyvus įrankis...
Daugiau skaitinių