„Aukšta kokybė“ nėra matavimas. Tai išvada, kuri turėtų kilti iš kelių nepriklausomų matavimų skirtingais biologiniais masteliais.
Procedūros žurnalas gali parodyti, ar buvo laikomasi protokolo. Kompiuterinė tomografija gali ištirti visą pacientą. Elektroninė mikroskopija gali atskleisti sinapses ir ląstelių membranas mažyčiuose audinio mėginiuose.
Nė vienas metodas atskirai nepakanka. Kartu jie kur kas geriau parodo, kas buvo išsaugota, kas galėjo būti pažeista ir kas lieka nežinoma.
Klausimai, į kuriuos turi atsakyti kokybės sistema
Rimtas kokybės vertinimas turėtų atskirti bent šešis klausimus:
- Kiek šiltosios ir šaltosios išemijos įvyko iki veiksmingos apsaugos?
- Ar kraujotaka ir vėsinimas smegenis pasiekė pakankamai greitai?
- Ar krioprotektorius pasiekė tikslinę koncentraciją ir ar jo pasiskirstymas buvo tolygus?
- Ar ledo susidarymas, edema, susitraukimas ar šiluminė įtampa paliko matomų pažeidimų?
- Ar išliko neuronų membranos, sinapsės ir kitos ultrastruktūros savybės?
- Ar kitas ekspertas gali patikrinti duomenis, metodus ir nukrypimus?
Kiekvienam klausimui reikia kito prietaiso. Geras rezultatas vienoje ašyje nepanaikina nesėkmės kitoje.
Pirmas sluoksnis: laiko juosta ir fiziologinės sąlygos
Įrašas prasideda dar prieš perfuziją. Svarbios laiko žymos apima būklės blogėjimą, komandos išsiuntimą, teisinį mirties konstatavimą, komandos atvykimą, vėsinimą, širdies ir plaučių palaikymą, operaciją ir krioprotekcinės perfuzijos pradžią.
Temperatūra turi būti registruojama laike ir, kai įmanoma, keliose kūno vietose. Vėsinimo kreivėje yra kur kas daugiau informacijos nei viename galutiniame rodmenyje.
Įraše taip pat turėtų būti vaistai, ventiliacija, širdies ir plaučių palaikymas bei didesni pertrūkiai. Šie kintamieji veikia kraujotaką ir biologinę naštą, susikaupusią iki vitrifikacijos.
Jie leidžia sudaryti S-MIX išeminio poveikio įvertį. S-MIX yra modelis, o ne audinio tyrimas, todėl jis turi likti viena atvejo profilio dalis.
Antras sluoksnis: perfuzijos telemetrija
Vykstant krioprotekcinei perfuzijai sistema gali registruoti slėgį, srautą, temperatūrą, tirpalo tūrį, kraujagyslių pasipriešinimą ir koncentraciją, patenkančią į pacientą bei iš jo išeinančią.
Lūžio rodiklis dažnai naudojamas kaip praktinis krioprotektoriaus koncentracijos pakaitalas. Galutinė vertė rodo, kas pasiekė mėginio ėmimo tašką grandinės išėjime, o ne kiekvieną mikroskopinę sritį.
Slėgio ir srauto kreivės gali atskleisti užsikimšimą, nutekėjimą ar kintantį kraujagyslių pasipriešinimą. Matoma edema, smegenų susitraukimas ir chirurginiai stebėjimai prideda anatominio konteksto.
Tai svarbūs proceso rodikliai. Jie negali įrodyti tolygaus prasiskverbimo į audinį, nes pažeistos ar užkimštos kraujagyslės gali palikti atskiras sritis nepakankamai apsaugotas.
Trečias sluoksnis: standartizuota viso kūno kompiuterinė tomografija
Tomografija yra pagrindinis šiuo metu prieinamas neardomasis matavimas po išsaugojimo, taikomas visam žmogaus kūnui.
Ji matuoja rentgeno spindulių slopinimą. Turint kalibruotus etaloninius duomenis, slopinimo raštai leidžia įvertinti krioprotektoriaus pasiskirstymą ir nustatyti sritis, kuriose koncentracija galėjo būti nepakankama arba susidarė ledas ar didelis struktūros pokytis.
Tomografija taip pat gali atskleisti didelius įtrūkius, dujas, ryškų patinimą ar susitraukimą ir sričių asimetrijas. Ji negali atskirti ląstelių, membranų ar sinapsių.
Kodėl svarbi skenavimo temperatūra
Tomografijos vertės iš dalies priklauso nuo fizinio tankio, o tankis kinta su temperatūra. Paskelbti tomografijos tyrimai parodė, kad temperatūra gali paslinkti išmatuotas slopinimo vertes.
Todėl skirtingose temperatūrose atliktų tyrimų palyginimas gali supainioti matavimo skirtumą su išsaugojimo skirtumu.
Tomorrow.bio kiekvieną krioprezervuotą pacientą skenuoja jam esant panardintam skystame azote maždaug -196°C temperatūroje.
Taip kiekvienas tyrimas turi tą patį kriogeninį atskaitos tašką, o temperatūra nustoja būti pagrindiniu skirtumų šaltiniu lyginant krioprotektoriaus tankio įverčius tarp atvejų.
Skenavimo protokolas ir kalibravimas vis tiek turi likti nuoseklūs. Temperatūros standartizavimas nepašalina visų skenerio, rekonstrukcijos ar interpretavimo kintamųjų.
Tomorrow.bio nurodo, kad šiuo metu yra vienintelė žmonių krioprezervacijos organizacija, taikanti šį panardinto ir vienodos temperatūros skenavimo protokolą kiekvienam pacientui.
Jos paskelbtoje kokybės programoje nurodoma, kad kiekvienas pacientas skenuojamas -196°C temperatūroje, o sritys spalvomis žymimos pagal numanomą krioprotektoriaus prasiskverbimą ir ledą.
Svarbi loginė asimetrija. Blogas tomografijos rezultatas yra problemos įrodymas. Geras rezultatas patvirtina makroskopinę krioprotekciją, bet negali įrodyti mikroskopinio išsaugojimo.
Ketvirtas sluoksnis: elektroninė mikroskopija ir smegenų ultrastruktūra
Elektroninė mikroskopija pasiekia mastelį, kurio tomografija nepasiekia.
Ji gali parodyti neuronų ir glijos membranas, aksonus, dendritus, mielino apvalkalus, mitochondrijas, kapiliarus, sinapsines pūsleles, sinapsinius plyšius ir postsinapsinius tankius.
Ji taip pat gali atskleisti su ledu susijusias tuštumas, suspaustą audinį, membranų trūkius, organelių išbrinkimą ir kitus raštus, būdingus osmosiniam ar paruošimo pažeidimui.
Tai svarbu, nes manoma, kad ilgalaikė atmintis iš dalies priklauso nuo išliekančio nervinio jungtingumo, sinapsių stiprumų rinkinių ir molekulinių bei subląstelinių savybių.
Ši 2025 metų neuromokslininkų apklausa parodė platų pritarimą struktūriniam atminties pagrindui, kartu atskleisdama neapibrėžtumą dėl kritinio mastelio ir pakankamo detalumo.
Todėl atpažįstamų sinapsių išsaugojimas yra informatyvesnis nei vien bendros smegenų formos išsaugojimas. Tačiau tai vis tiek neįrodo, kad išliko kiekviena su atmintimi susijusi savybė.
Nuo mikronuotraukos iki sinapsių žemėlapio
Viena elektroninės mikroskopijos nuotrauka rodo vieną itin ploną plokštumą. Ji gali parodyti vietinę struktūros kokybę, bet negali sudaryti grandinės žemėlapio.
Nuosekliųjų pjūvių elektroninė mikroskopija arba fokusuoto jonų pluošto skenuojamoji elektroninė mikroskopija gali fiksuoti vieną po kito einančius sluoksnius ir atkurti nedidelį audinio tūrį trimatėje erdvėje.
Tada tyrėjai gali atsekti neuritus ir nustatyti juos jungiančias sinapses. Tuo remiasi sinapsinės skiriamosios gebos konektomika.
Dabartiniai metodai gali kartografuoti mažus tūrius, gyvūnų smegenis ir atrinktus žmogaus audinių tūrius. Jie negali neardomuoju būdu sudaryti kiekvienos sinapsės žemėlapio nepažeistose krioprezervuotose žmogaus smegenyse.
Šis skirtumas užkerta kelią lengvam perdėjimui: elektroninė mikroskopija gali patikrinti, ar tirtų mėginių sinapsės ir vietinės grandinės struktūriškai išsaugotos. Viso žmogaus konektomo ji patvirtinti negali.
Tomorrow.bio nervinių mikromėginių programa
Tomorrow.bio prašo narių atskiro sutikimo paimti iki trijų mažų mėginių iš pasirinktų smegenų ar nugaros smegenų sričių ultrastruktūrinei analizei.
Mėginiai skirti elektroninei mikroskopijai ir protokolų tobulinimui. Mėginių ėmimas yra pasirenkamas ir nėra būtinas, kad narys gautų krioprezervaciją.
Paskelbtoje sutikimo informacijoje nurodoma, kad mėginiai imami iš sričių, laikomų mažiau svarbiomis atminčiai, tapatybei ir asmenybei.
Mikromėginys pateikia tiesioginį didelės skiriamosios gebos įrodymą, bet tik apie savo vietą. Mėginių ėmimo strategija, apdorojimo artefaktai ir aklas vertinimas veikia tai, kaip patikimai rezultatą galima apibendrinti.
Todėl viso kūno tomografija ir elektroninė mikroskopija vienas kitą papildo. Tomografija duoda plačią aprėptį, o elektroninė mikroskopija, vietinį gylį.
Penktas sluoksnis: vėsinimas ir šiluminė įtampa
Po perfuzijos vėsinimo įraše turi būti jutiklių vietos, temperatūros, greičiai, sulaikymai ir nukrypimai einant per stiklėjimo sritį.
Per lėtas vėsinimas gali leisti susidaryti ledui nepakankamai apsaugotose srityse. Per agresyvus vėsinimas gali sukurti didelius šiluminius gradientus ir mechaninę įtampą.
Tomografija po vėsinimo gali aptikti kai kuriuos makroskopinius įtrūkius. Mikroskopinis skilinėjimas ir molekuliniai pažeidimai gali likti žemiau jos skiriamosios gebos.
Todėl galutinė temperatūra svarbi mažiau nei visa šiluminė istorija ir tai, ką rodo matavimai po vėsinimo.
Šeštas sluoksnis: histologija, chemija ir funkciniai tyrimai
Elektroninė mikroskopija nėra vienintelis ardomasis tyrimo įrankis. Šviesos mikroskopija leidžia vertinti audinio sandarą, o biocheminiai žymenys leidžia tirti ląstelių membranas, baltymus ir pažeidimo kelius.
Eksperimentiniame audinyje atšildymas su vėlesniais elektrofiziologijos, medžiagų apykaitos ar gyvybingumo tyrimais duoda įrodymų, kurių vien struktūra suteikti negali.
Šie metodai vertingi protokolams tikrinti ir tobulinti. Daugumos jų negalima visapusiškai taikyti žmogaus pacientui, kurį ketinama toliau saugoti.
Laboratorinė sėkmė taip pat nepakeičia atvejo duomenų. Kontroliuojamas gyvūnų audinys ir tikras žmogaus atvejis gali skirtis išemija, liga, masteliu ir transportavimo istorija.
Saugojimo kokybė yra išsaugojimo kokybės dalis
Stiprios pradinės procedūros nepakanka, jei ilgalaikės sąlygos prastai kontroliuojamos.
Kokybės užtikrinimas turi apimti paciento tapatybę, saugojimo grandinę, padėtį saugykloje, skysto azoto lygį, temperatūros stebėjimą, signalizacijos istoriją, indų patikras ir dokumentuotą priežiūrą.
Šios patikros pirminės ultrastruktūros nepagerina. Jos parodo, ar pasiekta būsena buvo nuolat apsaugota.
Kaip ši atsakomybė atskiriama ir palaikoma, skaitykite skiltyje ilgalaikio saugojimo įstaiga.
Kokybė turi likti profiliu, o ne vienu balu
Atvejis gali turėti mažą įvertintą išemiją ir netolygų krioprotektoriaus pristatymą. Jis gali turėti gerą tomografinį tankį ir kartu nuviliančią mėginio ultrastruktūrą.
Jis taip pat gali rodyti puikią vietinę elektroninę mikroskopiją, o netirtos sritys liks neaiškios.
Pagrįstas rezultatas yra profilis: laiko juosta, šiluminiai duomenys, perfuzijos telemetrija, tomografinis pasiskirstymas, ultrastruktūros įrodymai, procedūriniai nukrypimai, saugojimo istorija ir neapibrėžtumas.
Šis profilis turi būti skelbiamas pakankamai išsamiose atvejų ataskaitose, lyginamas tarp atvejų ir naudojamas protokolams keisti, kai išryškėja pasikartojantys silpnumai.
Likę apribojimai aptariami skiltyje techniniai kokybiško išsaugojimo iššūkiai.
Trumpai: Krioprezervacijos kokybei reikia kelių matavimų: atvejo laiko duomenų, perfuzijos duomenų, valdomo vėsinimo, kriogeninės tomografijos, nervinio audinio elektroninės mikroskopijos, kai gautas sutikimas, ir tikrinamų saugojimo įrašų.
Išbandykite šią praktinę priemonę
Naudokite interaktyvią priemonę, kad išnagrinėtumėte šiame straipsnyje keliamą klausimą.
Įkeliamas interaktyvus įrankis...
Daugiau skaitinių