Vitrifikacija nebuvo vienas išradimas. Ji atsirado tyrėjams sprendžiant vieną po kito einančius skirtingus uždavinius: ląstelių, embrionų, organų ir galiausiai žmogaus biostazės.
Tikslas skamba paprastai: atvėsinti vandeningą audinį iki stiklo būsenos, kad nesusidarytų žalingas ledas.
Įgyvendinimas nėra paprastas. Krioprotektoriai gali būti toksiški. Jų įvedimas gali deformuoti ląsteles. Dideli objektai vėsta netolygiai, kaupia įtempius ir yra kur kas sunkiau atšildomi.
Todėl šiuolaikinės procedūros yra sistemos, o ne receptai. Jų kokybė priklauso nuo to, ar chemija, perfuzija, temperatūra, laikas, geometrija ir matavimai veikia išvien.
Prieš vitrifikaciją: šaltis sukeldavo antrą sužalojimą
Ankstyvoji krioprezervacija daugiausia reiškė užšaldymą. Šaltis lėtino chemines reakcijas, bet vanduo virsdavo ledo kristalais.
Ledas išstumia druskas ir kitas ištirpusias medžiagas į likusį skystį. Todėl ląstelės vienu metu gali patirti mechaninį poslinkį, kraštutines tirpalo koncentracijas, dehidrataciją ir membranų pažeidimus.
Greitesnis aušinimas gali sumažinti kristalus, bet paprastam vandeniui be cheminės pagalbos reikia neįtikėtino greičio, kad jis taptų stiklu. Tai pavyksta tik itin ploniems mėginiams.
Istorinis uždavinys buvo ne vien pasiekti žemą temperatūrą. Jį reikėjo pasiekti neleidžiant vandeniui persitvarkyti į žalingus kristalus.
1937 iki 1938: pirmieji kinetinės vitrifikacijos bandymai
Basile Luyet 1937 m. pasiūlė vitrifikaciją kaip biologinio išsaugojimo strategiją.
1938 m. Luyet ir Eugene Hodapp pranešė, kad varlių spermatozoidai atgavo judrumą po to, kai buvo dehidratuoti koncentruotu sacharozės tirpalu ir paveikti skystu oru.
Šis pirminis eksperimentas rėmėsi mikroskopinėmis plėvelėmis ir itin dideliu aušinimo greičiu. Jis parodė fizikinę galimybę, o ne organams pritaikomą protokolą.
Toks būdas dabar vadinamas kinetine vitrifikacija: kristalizacija aplenkiama šalinant šilumą greičiau, nei ledas spėja užsimegzti ir augti.
Mastelis šį būdą nugali. Paviršiaus plotas auga lėčiau nei tūris, todėl didelio mėginio vidurys nespėja sekti paskui paviršių.
1949: glicerolis pakeičia uždavinį
Christopher Polge, Audrey Smith ir Alan Parkes 1949 m. atrado, kad glicerolis gali apsaugoti spermatozoidus žemos temperatūros išsaugojimo metu.
Jų pranešimas žurnale Nature parodė, kokie praktiškai svarbūs yra į ląsteles skverbiantys krioprotektoriai.
Šios molekulės patenka į ląsteles, suriša vandenį ir sumažina ledo kiekį, susidarantį esant tam tikrai temperatūrai. Jos taip pat sumažina žalingą tirpalo koncentraciją užšaldymo metu.
Atradimas pakeitė kriobiologiją, nes aušinimo greitis nebebuvo vienintelis valdomas kintamasis. Cheminė sudėtis galėjo pertvarkyti paties vandens fazinę elgseną.
Kartu atsirado nauja optimizavimo problema. Daugiau krioprotektoriaus veiksmingiau slopina ledą, bet didina cheminę ir osmosinę žalą.
1959 iki 1968: daugiau medžiagų ir pakopinis įvedimas
1959 m. James Lovelock ir Marcus Bishop pranešė, kad dimetilsulfoksidas apsaugo kelių tipų ląsteles nuo šaldymo žalos.
DMSO pro kai kurias membranas prasiskverbdavo lengviau nei glicerolis. Jis išplėtė ląstelių, kurias galima apsaugoti, ratą ir iki šiol plačiai naudojamas laboratorinėje bei klinikinėje krioprezervacijoje.
Vėliau John Farrant tyrinėjo krioprotektoriaus koncentracijos didinimą kartu mažinant temperatūrą, laikant audinį koncentruotame skystyje ir sąmoningai nesudarant ledo.
Tai numatė esminį šiuolaikinių protokolų bruožą: krioprotektorių įvesti pakopomis, esant žemai temperatūrai, o ne iš karto veikti šiltą audinį visa koncentracija.
Pakopinis įvedimas riboja osmosinį šoką. Žemesnė temperatūra sulėtina daugelį cheminių reakcijų ir gali padaryti kitu atveju žalingą poveikį labiau pakeliamą.
1968 m. bandymai parodė, kad esant pakankamai didelei glicerolio koncentracijai raudonieji kraujo kūneliai gali pasiekti skysto azoto temperatūrą be matomo ledo.
Visos sąvokinės dalys jau buvo. Trūko praktinio būdo pritaikyti jas sudėtingam, kraujagyslėmis persmelktam audiniui.
1984: vitrifikacija tampa organų strategija
1984 m. straipsnis „Vitrification as an Approach to Cryopreservation“ naujai pristatė vitrifikaciją kaip rimtą kelią į organų bankus.
Ši strategija kartais vadinta pusiausvyrine vitrifikacija. Užuot reikalavus neįmanomo aušinimo greičio, naudojama tiek krioprotektoriaus, kad kritinis aušinimo greitis taptų pasiekiamas ir didesnėje sistemoje.
Toks poslinkis atskleidė tris tarpusavyje susijusius apribojimus:
- Tirpalas turi atsilaikyti prieš ledą esant pasiekiamiems aušinimo ir šildymo greičiams.
- Organas turi pakelti to tirpalo įvedimą ir pašalinimą.
- Krioprotektorius turi pasiekti kiekvieną sritį dar prieš prasidedant aušinimui.
Sudėtis galėjo puikiai veikti mėgintuvėlyje ir nepasiteisinti organe, nes rezultatą keitė kraujagyslių pasipriešinimas, difuzijos atstumas ar toksiškumas.
1985: gyvi embrionai grįžta iš stiklo būsenos
William Rall ir Gregory Fahy 1985 m. pranešė apie pelių embrionų krioprezervaciją be ledo esant -196°C.
Tai buvo lemiama biologinė demonstracija. Gyvos žinduolių ląstelės su branduoliais galėjo išgyventi aušinimą ir atšildymą per visiškai vitrifikuotą būseną.
Vis dėlto embrionai yra labai maži. Jų temperatūra ir koncentracija, palyginti su suaugusio žmogaus organu, kinta greitai ir tolygiai.
Rezultatas patvirtino metodą ir kartu dar ryškiau parodė mastelio problemą.
Mastelio problema skyla į keturias problemas
1. Krioprotektorių toksiškumas
Vitrifikacijai reikalinga koncentracija gali pažeisti baltymus, membranas ir ląstelių medžiagų apykaitą. Toksiškumas priklauso nuo medžiagos, koncentracijos, temperatūros, poveikio trukmės ir audinio tipo.
Tai reiškia, kad „mažiau toksiškas“ nėra vien vienos molekulės savybė. Tai viso įvedimo ir pašalinimo protokolo savybė.
2. Osmosinis įtempis
Koncentruotas tirpalas traukia vandenį iš ląstelių. Jį šalinant vanduo gali per greitai grįžti atgal.
Šiuolaikiniai protokolai naudoja laipsnišką koncentracijos didinimą, nešančiuosius tirpalus, temperatūros valdymą ir neįsiskverbiančias medžiagas, kad tūrio svyravimai neperžengtų pakeliamų ribų.
3. Netolygus pasiskirstymas
Organas nėra indas su vienalyčiu skysčiu. Krioprotektorius keliauja kraujagyslėmis, pereina kapiliarų sieneles ir difunduoja per audinį.
Krešuliai, edema, kraujagyslių ligos, išemija ir kraujo bei smegenų barjeras gali palikti kai kurias sritis žemiau koncentracijos, būtinos ledui slopinti.
Būtent todėl šiuolaikinė perfuzija matuoja slėgį, srautą, temperatūrą ir koncentraciją veninėje pusėje, o ne remiasi vien tirpalo tūriu.
4. Temperatūros skirtumai
Didelis objektas vėsta nuo išorės į vidų. Dėl skirtingų temperatūrų sritys traukiasi nevienodu greičiu.
Ties stiklėjimo riba ir žemiau jos medžiaga nebespėja atpalaiduoti įtempių. Jei įtempis viršija jos mechaninį stiprumą, gali susidaryti įtrūkiai.
Sprendimas buvo valdomo greičio aušinimas, atkaitinimas ties Tg ir lėtesnis leidimasis per stiklo sritį. Šie principai dabar formuoja kompiuterio valdomą žmogaus aušinimą.
1990-ieji ir 2000-ieji: mišiniai pakeičia mąstymą apie vieną medžiagą
Nė vienas krioprotektorius nebuvo optimalus visais atžvilgiais. Tyrėjai vis dažniau derino kelias įsiskverbiančias medžiagas, kad kiekviena prisidėtų nepasiekdama savo blogiausios koncentracijos.
Nešantieji tirpalai valdė jonų kiekį, pH ir osmosines sąlygas. Neįsiskverbiantys polimerai veikė audinio vandenį ir kraujagyslių elgseną.
Sintetiniai ledo blokatoriai buvo nukreipti prieš heterogeninį ledo užuomazgų susidarymą ir augimą. Jie sumažino priklausomybę vien nuo didelės krioprotektoriaus koncentracijos.
Tokie tirpalai kaip VS55 ir vėlesnis M22 buvo sisteminės inžinerijos pavyzdys: kelios medžiagos, ledo blokatoriai ir kruopščiai sukurta nešančiojo tirpalo chemija kartu su apibrėžtais perfuzijos bei temperatūros protokolais.
Vienoje 2004 m. organų vitrifikacijos apžvalgoje aprašoma pažanga mažinant toksiškumą, valdant šalčio sukeltus pažeidimus, ledo užuomazgas ir organų perfuziją.
Svarbiausia pažanga buvo ne ta, kad toksiškumas išnyko. Tyrėjai išmoko paskirstyti naštą tarp chemijos, laiko ir temperatūros.
Bandymai su triušių inkstais: svarbūs, bet lengvai pervertinami
Darbas su triušių inkstais parodė, kad kraujagyslėmis persmelktą žinduolio organą galima prisotinti sudėtingu vitrifikacijos tirpalu, atvėsinti iki stiklo būsenos, atšildyti ir transplantuoti.
Vienas aprašytas inkstas ilgesnį laiką palaikė triušio gyvybę kaip vienintelis veikiantis inkstas.
Šis rezultatas svarbus, nes peržengė ribą nuo mikroskopinių mėginių prie organo funkcijos. Bet jis nesukūrė patikimos klinikinės procedūros.
Vėlesnėje literatūroje pažymima, kad ilgalaikės transplantacijos sėkmės pakartoti nepavyko. Ribojantys veiksniai liko tirpalo pasiskirstymas, toksiškumas ir įprastas šildymas nuo paviršiaus.
Tokia ir yra teisinga pažintinė šio darbo vieta: reikšmingas principo įrodymas, turintis atkartojamumo ir mastelio problemą.
2015: išsaugojimo kokybė tampa matoma sinapsių lygmeniu
Aldehidais stabilizuota krioprezervacija sujungė cheminę fiksaciją, krioprotektorių perfuziją ir vitrifikaciją triušių bei kiaulių smegenyse.
Šiame 2015 m. tyrime aprašytos aiškios membranos, sinapsės, pūslelės, mielinas ir tarpląstelinės struktūros po atšildymo ir paruošimo elektroninei mikroskopijai.
Jis parodė, kad puiki nervinio audinio ultrastruktūra gali išlikti per visą saugojimo be ledo ciklą net ir didelėse smegenyse.
Jis neparodė gyvybingo atsigavimo. Fiksacija aldehidais sąmoningai sujungia biologinę medžiagą skersiniais ryšiais ir yra nesuderinama su įprastu gyvybinių funkcijų atkūrimu.
Taigi eksperimentas atsakė į struktūros klausimą, o ne į visą atgaivinimo klausimą.
Platesnis jo indėlis buvo metodologinis: išsaugojimą reikia vertinti tiriant pačias dominančias struktūras, o ne vien stebint, kad mėginys atrodo stiklinis.
2023: nanošildymas išsprendžia atšildymą žiurkių inkstuose
Aušinimas yra tik pusė grįžtamosios krioprezervacijos. Atšildymas dažnai yra sunkesnis.
Jei šildoma per lėtai, devitrifikacijos metu gali užaugti ledas. Jei šiluma ateina daugiausia nuo paviršiaus, temperatūros skirtumai gali suskaldyti organą.
Nanošildymas sprendžia abi problemas: kraujagyslėmis paskirstomos geležies oksido nanodalelės ir kaitinamos kintamu radijo dažnio magnetiniu lauku.
2023 m. tyrėjai vitrifikavo žiurkių inkstus, laikė juos iki 100 dienų, atšildė nanošildymu ir transplantavo.
Atkurti inkstai stebėjimo laikotarpiu atstatė gyvybei palaikyti būtiną inkstų funkciją recipientams, neturėjusiems savų inkstų.
Šis laimėjimas rėmėsi ne vien šildymu. Komanda perėjo prie mažiau toksiškos sudėties ir modeliavo krioprotektoriaus įvedimą, kad padidintų jo koncentraciją audinyje.
Tai pasikartojanti vitrifikacijos istorijos pamoka: išsprendus vieną siaurąją vietą atsiveria kita, o sėkmingam atsigavimui reikia visos grandinės.
2024 iki 2026: didesnės fizikinės sistemos ir veikiantis nervinis audinys
2024 m. tyrėjai pranešė apie fizikinę vitrifikaciją žmogaus organo masteliu 0.5 iki 3 litrų sistemose.
Jie derino vidinę termometriją, atkaitinimą, valdomą aušinimą ir mikrotomografinį tikrinimą. Taip pat parodė nanošildymą iki 2 litrų tūriuose.
Didžiausios demonstracijos buvo daugiausia fizikinės. Išvengti matomo ledo ir įtrūkių būtina, bet tai neįrodo žmogaus dydžio organo biologinio atsigavimo.
2026 m. PNAS tyrime aprašytas trumpalaikis suaugusių pelių hipokampo audinio funkcijų atsigavimas po vitrifikacijos ir atšildymo.
Tyrime matuota morfologija, mitochondrijų reaktyvumas, neuronų jaudrumas, sinapsinis perdavimas ir ilgalaikė potenciacija.
Tirti pelių smegenų pjūviai ir nedidelio išeigos ištisų smegenų preparatai, o ne žmogaus smegenys. Todėl reikšmė siauresnė, bet vis tiek svarbi.
Buvo parodyta, kad suaugusio žinduolio nervinis audinys gali atgauti elektrofiziologines funkcijas po to, kai stiklo būsenoje molekulinis judrumas buvo sustojęs.
Žmogaus biostazė paveldi šį mokslą sunkesnėmis sąlygomis
Organų banko eksperimentai prasideda nuo sveiko audinio, valdomo laiko ir iš anksto suplanuotos prieigos prie kraujagyslių.
Žmogaus biostazė prasideda po teisinės mirties. Liga, šilta išemija, krešėjimas, edema, transportavimas ir kraujagyslių ligos gali trukdyti krioprotektoriui pasiskirstyti.
Artimiausias tikslas yra struktūros išsaugojimas galimam ateities atkūrimui, o ne šiandien grįžtama transplantacija.
Dėl šio skirtumo laboratorinių teiginių negalima tiesiogiai perkelti į teiginius apie pacientus.
Kaip Tomorrow.bio pritaikė vitrifikaciją lauko sąlygoms
Tomorrow.bio perkėlė viso kūno krioprotekcinę perfuziją į specialius greitosios pagalbos automobilius. Procedūrą galima pradėti šalia paciento, nelaukiant transportavimo į Šveicariją.
Tai pakeičia svarbų pradinį veiksnį, kurio chemija ištaisyti negali: išemijos trukmę iki perfuzijos.
Dabartiniame protokole naudojama VM-1 pagrindu sukurta tirpalo chemija, pritaikyta krioprotekcijai lauko sąlygomis ir vėlesniam transportavimui su sausuoju ledu.
Pagal EBF mokslinių tyrimų programą VM-1 buvo išbandytas modeliuojamomis pomirtinėmis sąlygomis, įskaitant tris valandas šiltos išemijos.
Programoje matuotas veninio kraujo lūžio rodiklis, perfuzijos trukmė, svorio pokytis, smegenų susitraukimas ir ledo susidarymas, kartu bandant perfuzato bei procedūros pakeitimus.
Tai ir yra praktinė riba žmonių atvejais: klausimas ne tas, ar idealus tirpalas gali vitrifikuotis, o tas, kaip gerai galima perfuzuoti realų išemijos paveiktą pacientą.
Matavimai tapo procedūros dalimi
Ankstyvuosiuose vitrifikacijos tyrimuose sėkmė dažnai buvo nustatoma pagal skaidrumą, kalorimetriją, rentgeno difrakciją, išgyvenamumą ar funkciją po atšildymo.
Žmogaus biostazė negali naudoti atsigavimo kaip šiandieninio galutinio rodiklio. Todėl jai reikia neardomųjų ir mėginiais grįstų išsaugojimo kokybės matų.
Tomorrow.bio kiekvienam pacientui atlieka kompiuterinės tomografijos tyrimą toje pačioje skysto azoto temperatūroje, kad standartizuotomis sąlygomis įvertintų krioprotektoriaus pasiskirstymą ir nustatytų ledą ar makroskopinius defektus.
Gavus atskirą sutikimą, nerviniai mikromėginiai gali padėti elektronine mikroskopija įvertinti membranas, sinapses ir vietinę ultrastruktūrą.
Šie metodai ir jų ribos aprašyti skyriuje biostazės kokybės patikros procedūros.
Matavimai keičia ir patį tobulinimą. Kai nesėkmė tampa matoma ir palyginama tarp atvejų, chemijos bei protokolo pakeitimus galima nukreipti tiksliai į ją.
Kas pagerėjo ir kas dar neišspręsta
Šiuolaikinė vitrifikacija pasiekė kelis dalykus, kurių ankstyvasis užšaldymas negalėjo:
- Daugelio ląstelių, embrionų ir mažų audinių išsaugojimas be ledo.
- Vitrifikuotų gyvūnų organų funkcijos atkūrimas apibrėžtuose eksperimentuose.
- Sinapsių lygmens struktūros išsaugojimas fiksuotose žinduolių smegenyse.
- Kompiuterio valdomas didesnių sistemų aušinimas ir atkaitinimas.
- Tūrinis atšildymas tokiomis technologijomis kaip nanošildymas.
- Kompiuterinės tomografijos ir elektroninės mikroskopijos metodai realiems išsaugojimo rezultatams matuoti.
Ji nesukūrė grįžtamos viso žmogaus kūno krioprezervacijos.
Tarp likusių problemų yra pomirtinė išemija, netolygi perfuzija, krioprotektorių toksiškumas, kraujo ir smegenų barjero poveikis, viso kūno temperatūros skirtumai, įtrūkių vengimas ir saugus tolygus atšildymas.
Net ir sėkmingas struktūros išsaugojimas paliktų ateičiai atkūrimo, atgaivinimo ir pirminės mirties priežasties gydymo problemas.
Šie skirtumai plačiau aptariami skyriuje techniniai grįžtamosios krioprezervacijos iššūkiai.
Trumpai: Vitrifikacija tobulėjo dėl geresnių krioprotektorių, perfuzijos, ledo kontrolės, aušinimo, atšildymo ir struktūros matavimų. Kai kurios problemos išspręstos mažu masteliu, o viso žmogaus grįžtamumas lieka neišspręstas.
Išbandykite šią praktinę priemonę
Naudokite interaktyvią priemonę, kad išnagrinėtumėte šiame straipsnyje keliamą klausimą.
Įkeliamas interaktyvus įrankis...
Daugiau skaitinių